А.П. ОБРЯДИНА, Т.И. УЛАНОВА
ООО «Научно-производственное объединение «Диагностические системы»,

Нижний Новгород
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «ДС-ИФА-HBeAg» и «ДС-ИФА-анти-HBe» ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДОВ ОСТРОГО И ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА В
Гепатит В – вирусное инфекционное заболевание, характеризующееся тяжелым

воспалительным поражением печени . Около 1% летальных исходов наблюдается в

острый период болезни, в 4-10 % случаев происходит трансформация в хронический

процесс с возможным формированием в последующем цирроза печени и первичной

гепатокарциномы .

Несмотря на тенденцию к снижению заболеваемости острым гепатитом В, продолжает формироваться опасная в эпидемиологическом плане группа больных, которым впервые поставлен диагноз «хронический вирусный гепатит», а также группа носителей возбудителя заболевания. Сохраняется неблагополучный прогноз, связанный с высокой заболеваемостью гепатитом В среди населения репродуктивного возраста, а также среди подростков .

Поэтому, сейчас особенно актуальны вопросы лечения, профилактики и диагностики гепатита В. В настоящее время для детекции маркеров этой инфекции широко применяются методы иммуноферментного анализа. К числу важнейших серологических маркеров ВГВ относятся е-антиген (HBeAg) и антитела к е-антигену (анти-HBe). HBeAg ассоциируется с высокой инфицированностью крови, свидетельствуя об активной репликации вируса гепатита В (HBV). Установлено, что высокие титры HBeAg соответствуют высокой ДНК-полимеразной активности и всегда сочетаются с обнаружением полных частиц Дейна . При попадании сыворотки, содержащей HBeAg, в кровь здорового человека опасность заражения на много порядков выше, чем после наступления сероконверсии.

При остром гепатите В HBeAg обнаруживается в крови на ранних этапах инфекционного процесса уже при первых клинических проявлениях болезни, отставая на неделю от появления HBsAg. Острый гепатит В (ОГВ) циклического течения характеризуется кратковременной циркуляцией HBeAg. Вскоре, на 2-3 неделе желтушного периода появляются анти-HBe, что позволяет прогнозировать благоприятный исход заболевания .

Анти-HBe циркулируют в крови на протяжении 2-5 лет, реже несколько месяцев.

Наступление сероконверсии HBeAg-антиHBe знаменует резкое снижение активности

инфекционного процесса . Обнаружение HBeAg в крови пациентов после 2-х месяцев заболевания обозначает хронизацию патологического процесса . В этом случае анти-HBe могут образовываться спустя много лет после появления антител к HBcAg или вовсе не выявляться.

Появление анти-HBe может иметь неблагоприятное прогностическое значение в

остром периоде ВГВ при тяжелых формах, что соответствует мутации в pre-core зоне с

образованием HBV «e-» штамма .

Целью данной работы была разработка высокочувствительных и специфичных

иммуноферментных тест-систем для выявления HBeAg и анти-HBe и оценка их основных характеристик.

Материалы и методы.

1. Иммуноферментная тест-система «ДС-ИФА-HВeAg». Действующим началом теста

являются поликлональные антитела козы к рекомбинантному HBeAg, производства НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород, сорбированные на твердую фазу, и конъюгат, представляющий собой поликлональные антитела козы к рекомбинантному HBeAg, меченные пероксидазой хрена, производства НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород. Схема проведения анализа представляет собой одностадийный «сэндвич».Общая продолжительность реакции 1,5 часа. Образец сыворотки анализируется неразведенным.

2. Иммуноферментная тест-система «ДС-ИФА-анти-HBe». Основу теста составляют

рекомбинантный HBeAg (AHBV 102), производства НПО «Диагностические системы»,

Нижний Новгород, сорбированный на твердой фазе и конъюгат анти-IgG с пероксидазой хрена, производства «Сорбент Сервис», Москва. Реакция проходит в две стадии. К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку в разведении 1/10 и, после инкубации и удаления не связавшихся компонентов, проводят выявление специфических иммунокомплексов с помощью мышиных моноклональных антител против IgG человека, меченных пероксидазой хрена.

3. Для оценки разработанных тест-систем было использовано 2178 образцов сывороток

крови. Из них 480 образцов сывороток здоровых доноров. 1680 образцов представляют

собой образцы сывороток крови, содержащие различные маркеры вируса гепатита В.

Восемнадцать образцов были получены в динамике от больных с клиническим диагнозом «острый вирусный гепатит В». Предварительно все образцы были проверены на наличие HBsAg, HBeAg, анти-HBe, анти-HBc с помощью тест-систем производства НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород: «ИФА-НВsAg/m», «ДС-ИФА-НВеAg», «ДС-ИФА-анти-HBe», «ИФА-анти-НВс».

4. Сравнительную оценку разработанных тест-систем осуществляли с помощью

коммерческого препарата «Monolisa HBe», производства BIO-RAD, Франция;

Результаты и обсуждение. В НПО «Диагностические системы» разработаны 2 новых диагностикума: «ДС-ИФА-HBeAg» и «ДС-ИФА-анти-HBe». Тест-система «ДС-ИФА-HBeAg» предназначена для выявления е-антигена вируса гепатита В в сыворотке (плазме) крови людей методом иммуноферментного анализа и может быть использована для специфической диагностики, определения активности инфекционного процесса, прогнозирования тяжести и исхода гепатита В.

Тест-система «ДС-ИФА-анти-HBe» предназначена для выявления антител класса IgG к е-антигену вируса гепатита В в сыворотке (плазме) крови человека и может быть

использована при прогнозе течения инфекционного процесса и контроле проводимой терапии при гепатите В.

Для изучения специфичности новых тестов была проведена оценка распределения

оптической плотности (ОП) образцов сывороток крови, содержащих и не содержащих

НВeАg или анти-НВе. Были использованы образцы сывороток крови здоровых доноров и образцы сывороток крови, отобранные по различным маркерам вируса гепатита В на

станциях переливания крови. Результаты исследования показали достоверное разделение двух популяций. Значения ОП образцов сывороток, не содержащих НВеАg, колебались в пределах от 0,011 до 0,111, а основной пик образцов сывороток, содержащих НВеАg находился в пределах от 2,186 до 3,186 (рисунок 1а).

Рис.1a. Распределение ОП образцов сывороток, содержащих и не содержащих HBeAg в тест-системе «ДС-ИФА- HBeAg »
Пик, соответствующий группе сывороток с низкой ОП (0,3-0,6), вероятно, составляют образцы сывороток, отобранные на ранних этапах инфекционного процесса.

Уже в инкубационном периоде у больных закономерно регистрируются в крови НВsAg и НВеАg, что подтверждает их потенциальную эпидемиологическую опасность.

Диапазон оптической плотности образцов сывороток, не содержащих анти-НВе

находился в пределах от 0,002 до 0,122, а основной пик ОП образцов сывороток, содержащих анти-НВе, находился в пределах от 2,431 до 3,231(рисунок 1б).

Рис. 1б. Распределение ОП образцов сывороток, содержащих и не содержащих анти-Н Be , в тест-системе «ДС-ИФА-анти- HBeAg »
Были изучены особенности распределения ОП анти-НВе положительных образцов

сывороток, содержащих (n =78) и не содержащих HВsAg (n =56).


Рис. 2а. HBe -положительных образцов сывороток, содержащих HBsAg в тест-системе «ДС-ИФА-анти- HBe ».

Рис.2б. Особенности распределения ОП анти- HBe -положительных образцов сывороток, не содержащих HBsAg в тест-системе «ДС-ИФА-анти- HBe ».
Оптические плотности 87% анти-HBe-позитивных образцов сывороток, не содержащих HВsAg, находились в пределах от 0,41до 0,81 (рисунок 2б). При этом лишь у 14% анти-HBe-положительных образцов сывороток, содержащих HВsAg, ОП была в этом диапазоне (рисунок 2а). Известно, что в фазу поздней реконвалесценции при отрицательной реактивности на НВsAg постепенно происходит снижение титров антител к НBеAg (рисунок 2б). Поэтому, возможно, преимущественная концентрация анти-НВе-положительных образцов соответствовала ОП меньше 0,8.

Полученные данные свидетельствуют о достоверности разделения положительных и

отрицательных образцов сывороток крови независимо от стадии заболевания. Изучение чувствительности и специфичности тест-систем «ДС-ИФА-HBeAg» и «ДС-ИФА-антиHBe» проводили в сравнении с тестом «Monolisa HBe» («BIORAD»,Франция) (таблица 1).

Таблица 1
Сравнительная характеристика чувствительности и специфичности

тест-систем ДС-ИФА-HВeAg и ДС-ИФА-антиHB

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, 100%-ное совпадение результатов.

Известно, что дополнительное прогностическое значение имеет сочетанная индикация НВеАg и анти-НВе, особенно их количественная оценка. Быстрое нарастание титра анти-НВе характеризует активный гуморальный иммунный ответ и практически исключает угрозу хронизации . Нами проанализировано изменение содержания НВеАg/анти-НВе в образцах сывороток крови пациентов с клиническим диагнозом «острый вирусный гепатит В» (таблица 2).

Таблица 2
Динамика сероконверсии НВеАg/анти-НВе у больных ОГВ

* от поступления в стационар
Все образцы сывороток были исследованы на наличие серологических маркеров

ОГВ: НВsAg, анти-НВс, анти-НВс IgM. Период наблюдения варьировал от 13 до 38 дней. У больных №1, №2 и №6 анти-НВе обнаружены уже на фоне снижения титра НВеАg. У пациентов №3 и №4 анти-НВе появились после исчезновения из сыворотки крови НВеАg на 21 и 8 день соответственно. Анализ детекции НВеАg в сыворотке крови пациента №5 при поступлении в стационар показал отрицательный результат. При этом была зарегистрирована конверсия на анти-НВе уже в первый день обследования.

У всех обследуемых прослежена тенденция к увеличению титра антител к НВеАg в

сыворотке крови, что позволяет прогнозировать благоприятную динамику клинических

проявлений ОГВ и скорое выздоровление.

Проведенное изучение новых тест-системы показало их высокую диагностическую надежность. Результаты сравнения ДС-ИФА-HBeAg» и «ДС-ИФА-антиHBe» показали 100% совпадение с тестом «Monolisa HBe».

При исследовании образцов сывороток больных гепатитом В в динамике, тесты

подтвердили высокую чувствительность и специфичность.

Короткое время инкубации исследуемых образцов и конъюгата (1 ч) позволяет в минимальные сроки определить правильную тактику проведения лечебных мероприятий. Созданные тест-системы удобны в постановке, экономичны (требуется 50 мкл сыворотки для определения HBeAg и 10 мкл сыворотки для определения анти-HBe). Высокие качественные характеристики тестов позволяют успешно использовать их при прогнозе течения инфекционного процесса и контроле проводимой терапии при гепатите В.
ЛИТЕРАТУРА

1.Майер К.П. Гепатит и последствия гепатита / К.П. Майер.– М., ГЕОТАР, Медицина,1999.- C.720

2.Онищенко Г.Г. Распространение вирусных гепатитов как угроза национальной безопасности / Г.Г. Онищенко, Л.А. Дементьева // Журнал микробиологии. –2003.-№ 4.- С.93-99.

3.Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты / С.Н.Соринсон. - Санкт-Петербург, Теза, 1997.- 306 С.

4. Baumeister M. Hepatitis B Virus e Antigen Specific Epitopes and Limitations of Commercial Anti-HВe Immunoassays / M. Baumeister // Journal of Medical Virology.- 2000.-N 60.- Р.256-263.

5.Kane M. Global program for control of hepatitis B infection / M. Kane// Vaccine. – 1995.-N131(Suppl. 1).- Р.47-6. Shunichi Sat о . Hepatitis B Virus Strains with Mutations in the Core Promoter in Patients with Fulminant Hepatitis / Shunichi Sato, Kazuyuki Suzuki // Annals of Internal Medicine. – 1995.- N122.- Р.241-248.

7. Ou J.- Н . Molecular biology of hepatitis B virus e antigen./ J.-Н.Ou // Journal of Gastroenterology and Hepatology. – 1997.- № 12 (Suppl.1)- Р. 178- 187.

8.Tiollais P. The hepatitis B virus. / P.Tiollais, C.Pourcel, A.Dejean // Nature. – 1985. – P.317, 489-495
Опубликовано: Ж. «Клиническая лабораторная диагностика» - 2005.-№6-С.-34-37

ВИЧ – бич нашего поколения. Какие существуют методы для диагностики ВИЧ, углубленная информация о ИФА-тесте на ВИЧ. Как сдавать, как трактовать результаты анализа.

Вирус иммунодефицита человека – одна из самых страшных инфекций для нашего поколения.

ВИЧ деструктивно влияет на нашу иммунную систему, и если вовремя не остановить прогресс заболевания, он может трансформироваться в синдром приобретенного иммунодефицита . ВИЧ распространяется через непосредственный контакт партнеров при сексуальном акте через мужские и женские половые органы. Еще одной причиной заражения может стать попадание вируса через кровь. Это происходит вследствие использования нестерильных инструментов, переливанием зараженной крови и даже через поколения: ребенку от инфицированной матери при кормление грудью.

До сих пор ученые по всему миру ломают голову над созданием лекарства нового поколения, способного излечить от СПИДа, однако, несмотря на большие темпы научного прогресса, вирус иммунодефицита человека продолжает распространяться по планете.

ИФА – метод диагностики ВИЧ

Учеными поколения 20-го века разработано несколько методов диагностики ВИЧ, важнейшим из которых считают иммуноферментный анализ. ИФА на ВИЧ стали проводить относительно недавно – в начале девяностых годов. С течением времени метод оттачивался, приобретал новые детали. Теперь достоверность метода ИФА одна из самых высоких – около 98%. Соответственно, такой метод проводится все чаще.

ИФА – первый анализ, с которым сталкивается пациент при обследовании на ВИЧ. Метод ИФА определяет наличие в крови антител. Если тест находит присутствие антител в крови, значит, и вирус присутствует. Однако, информацию по этому тесту необходимо подкреплять и другими анализами, такими как иммунный блоттинг (ИБ) и метод последнего поколения – полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Антитела – специальные белковые соединения, которые продуцируют плазматические клетки после как реакцию на попадание в организм инфекции (антитела начинают образовываться через 1-2 месяца с момента заражения).

Причины возникновения ВИЧ

Врач выпишет вам направление на анализ, если вы контактировали с человеком, зараженным ВИЧ либо существует опасность инфицирования. К группе опасности заражения ВИЧ относят поколения людей:

• проходящих в течение месяца курс инъекционного лечения;
• имеющих сексуальные отношения без специальных средств предохранения;
• переносчиков инфекций, передающихся во время сексуального контакта;
• пациентам после прохождения процедуры переливания крови либо укола обнаружения причины свертывания крови в восьмидесятые годы.

Если у вас есть сомнения относительно вашего ВИЧ-статуса и опасения, связанные с возможностью заражения, рекомендуется незамедлительно обратиться за помощью в любое медицинское учреждение нашей страны для проведения комплексного обследования на ВИЧ. Результат на анализы получают в течение месяца. Людям в группе риска по ВИЧ рекомендуется проходить обследование через каждые 4 месяца.

Как сдать анализ

Какой-то особенной подготовки к сдаче анализа крови на ВИЧ не требуется, однако лучше придерживаться простейших правил:

• лучше не кушать с вечера, а сдавать анализ натощак утром;
• не советуют загружать организм физической работой;
• употреблять здоровую пищу, воздержаться на некоторое время от сигарет и алкоголя;
• для исключения ложных показателей теста не стоит сдавать анализ после лечения серьезных заболеваний.

Исследование образцов крови при помощи ИФА на ВИЧ-инфекцию - это один из самых ранних и достоверных методов диагностики. Иммуноферментный тест состоит в числе немногих исследований наряду с ПЦР, которые с большой степенью вероятности подтверждают либо опровергают такой страшный диагноз, как ВИЧ-инфекция или СПИД. С момента выявления первых случаев заражения вирусом иммунодефицита на территории советского пространства, а это 1983 год. Лекарство, которое полностью бы исцеляло эту инфекцию, а также вакцина к ней, не были изобретены, но этот процесс находится в стадии активной разработки. А пока что, только ранняя диагностика ВИЧ-инфекции позволяет держать патологический процесс под контролем.

Информационный экскурс о ВИЧ-инфекции

Вирус иммунодефицита у человека относится к ретровирусам, которые обусловливают медленное течение заболевания. Проникая в организм, вирус иммунодефицита воздействует в первую очередь на лимфоидную ткань. Здоровый иммунитет вырабатывает Т-лимфоциты для того, чтобы распознать вновь прибывшего вирусного агента. После чего дать информацию антителам, по каким признакам узнать вирус иммунодефицита и уничтожить его. Процесс «опознания» вируса иммунодефицита происходит при помощи белков-рецепторов CD4. Но именно на этом этапе наблюдается нечто странное, то, что вот уже много лет не позволяет победить чуму XX века.

Клетка иммунитета СD4 для распознавания чужеродного агента вступает в контакт с вирусом иммунодефицита. В этот момент вирус иммунодефицита прикрепляется к мембране лимфоцита, сливается с оболочкой рецептора и внедряет в клетку иммунитета капсулу со своей генетической информацией и специфическими вирусными белками. И клетка, отправленная на вычисление вируса иммунодефицита, с этих пор сама становится зараженной. Но происходит все, к сожалению, не с одной клеткой, а в очень крупных масштабах. Иммунная система человека в ответ уже на «бывшие свои», а ныне зараженные клетки, создает новые антитела. Но вирусы иммунодефицита, по описанной ранее схеме, снова и снова производят захват клеток-защитников.

Таким образом, иммунитет человека попадает в замкнутый круг. Помочь организму можно только, если проводить высокоактивную антиретровирусную инфекцию (ВААРТ). А также перейти на полностью здоровый образ жизни и питания, что освободит большие ресурсы иммунитета от лишней работы. Ученые всего мира объединили свои усилия и постоянно проводят исследования в поисках эффективного лекарства против ВИЧ-инфекции.

Не так давно был произведен эксперимент с белком ССR5, который обеспечивает врожденную невосприимчивость организма определенной части людей к заражению ВИЧ-инфекцией. Ученые подвергли кровяную субстанцию людей добровольцев генной терапии, чтобы внедрить ССR5 в клетки Т-хелперов. У всех подопечных это привело к масштабному снижению числа ретровирусных ДНК. А у одного пациента вирус иммунодефицита этот метод позволил ликвидировать полностью. На основании данного эксперимента можно пока еще только предположить в единичном случае об успешной победе над страшной чумой XX века.

Начиная с 2016 года, эта деятельность продвинулась значительно вперед. Получены ошеломляющие по эффективности результаты девяносто процентного уничтожения вируса иммунодефицита при помощи атакующих антител, выделяемых мышечной тканью в обход захваченному иммунитету. Для этого в мышечную ткань подопытных живых существ вживляли специальный ген, продуцирующий эти самые клетки-киллеры для уничтожения ВИЧ-инфекции. Но на людях этот метод пока еще не применялся, хотя планируется в ближайшие годы.

Тем более не имеет смысл падать духом. А лучше как можно раньше выявить вирус иммунодефицита, что можно сделать при помощи ИФА, если имел место риск заражения. И в случае подтверждения диагноза, поддерживать свой иммунитет посредством ВААРТ до тех пор, пока новое лекарство от ВИЧ-инфекции будет обнародовано.

Диагностика ВИЧ-инфекции

Метод ИФА на ВИЧ-инфекцию нацелен на обнаружение в образце крови человека антител к вирусу иммунодефицита. Попадая в организм, ретровирусы к группе которых относится ВИЧ-инфекция, не сразу начинают активный захват иммунных клеток СD4 (Т-лимфоцитов). Но дожидаться, пока агрессивные агенты начнут смертельную деятельность в организме не стоит. Не секрет, что при любом заболевании, и ВИЧ-инфекция не является исключением, чем раньше начата терапия, тем эффективнее исцеление.

Когда дело касается вируса иммунодефицита человека, случаи полного исцеления официально зафиксированы не были. Но это совсем не значит, что нужно опустить руки, и пустить заболевание на самотек. С ВИЧ-инфекцией люди живут до 75–80 лет при условии выявления на начальной стадии и постоянной поддерживающей терапии.

Метод иммуноферментной диагностики ВИЧ-инфекции имеет высокую достоверность около 97–99%. Но именно эта незначительная часть в 1–3% может давать ложноположительный либо ложноотрицательный результат диагностики ВИЧ-инфекции при помощи ИФА. Для этих целей, чтобы окончательно подтвердить или опровергнуть показания иммуноферментного анализа, применяется анализ, именуемый иммуноблот (ИБ).

Что представляют собой методы ИФА и ИБ на ВИЧ-инфекцию

Иммунноферментный метод на ВИЧ-инфекцию 4-го поколения направлен не только на поиск и идентификацию патогенных клеток, но и на установления их численности. Следовательно, один иммуноферментный тест объединяет в себе качественное и количественное исследование. Метод ИФА 4-го поколения на ВИЧ-инфекцию на сроке от шести недель с момента предположительного заражения покажет 100% высокую достоверность результатов.

В основании иммуноферментного исследования лежит взаимодействие специфических антител и родственных им антигенов. Благодаря специальному ферменту, и происходит образование совокупности «антиген-антитело». Чтобы осуществить эту реакцию по обнаружению иммуноглобулинов к ВИЧ-инфекции, в полистероловую панель с 96-ю лунками, в которых в твердой форме находятся рекомбинантные белки (сорбированные), помещают образец крови. Оказавшиеся в емкости с сывороткой крови антигены либо антитела распознают известный им объект и образуют с ним соединение «АТ-АГ». Для установления антител к вирусам иммунодефицита 1 и 2 типов применяется также тест ДС ИФФ на ВИЧ АГ-АТ.

Преимущества иммуноферментного метода на ВИЧ-инфекцию 4-го поколения:

• Высокая достоверность, более 96%. Ложные результаты чаще являются причиной не самого анализа, а неправильной подготовки или недавно перенесенного респираторного заболевания.
• Определение как наличия, так и численности иммуноглобулинов.
• Возможность отслеживать результат при проведении терапии ВИЧ-инфекции.
• Скорость получения результатов анализа на ВИЧ-инфекцию, которая составляет несколько часов, если проводится в диагностическом центре.
• Анализ на ВИЧ-инфекцию четыре, иммуноферментная реактивность которого значительно выше предшественников, информативен в период серологического окна вируса иммуннодефицита.

Иммунный блотинг является скринингом и назначается для определения типа антигена. Скрининговое исследование ИБ используют как верифицирующий тест при ВИЧ-инфекции через 5–7 недель после проведения ИФА. Метод ИБ основан на применении электрофореза для разделения антигенов вирусов иммунодефицита. Процесс разделения антигенов дает возможность обнаруживать специфические иммуноглобулины к каждому конкретному антигену ВИЧ-инфекции.

Иммунноблотинг применяют, когда иммуноферментный тест ВИЧ-инфекции два раза подряд показывает ложноположительный или ложноотрицательный результат. Подозрения могут возникнуть при отсутствии или наоборот наличии характерных симптомов ВИЧ-инфекции. Хотя здесь тоже могут возникать различные вариации.

Расшифровка результатов ИФА на инфекцию ВИЧ-инфекцию

В случае, когда ИФА плюс подтверждается скринингом ИБ положительным, сомнений не возникает, у пациента в организме присутствует вирус иммунодефицита. Но если, к примеру, ИФФ на ВИЧ положительный, а иммуноблот отрицательный, то делают вывод об инфицировании «минус», то есть о его отсутствии.

Только в такой ситуации пациента все равно отправляют на дополнительное обследование, чтобы исключить наверняка вирус иммунодефицита.

А при иммуноферментном анализе на ВИЧ 4 поколения «минус», а иммуноблоттинге положительном, возможно в организме присутствует иная инфекция. Возможно у человека какое-либо аутоиммунное заболевание, онкологический процесс, бывает псориаз кожи или суставов дает ложноположительные результаты как ИФА, так и ИБ.

Еще такой вариант, когда иммуноферментный тест на ВИЧ-инфекцию показывает результат «минус» и иммунноблот также со значением «минус», здесь остается только порадоваться по причине отсутствия вируса иммунодифицита. Но при наличии специфических признаков, присущих ВИЧ-инфекции или, если человек состоит в тесном контакте с ВИЧ положительным пациентом. Тогда будет тоже необходимо провести дополнительную диагностику, например полимеразную цепную реакцию (ПЦР). К тому же при сомнительных показателях «минус» или «плюс», пациенту рекомендуется пересдать кровь через 4, а лучше 6 месяцев.

Норма и отклонение числа Т-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции:

• Норма Т-клеток от 1000 до 2900 мкл.
• СПИД ранний от 500 до 200 мкл.
• СПИД поздний менее 200 мкл.

Болезнь легче предотвратить, чем лечить ― это все известная мудрость. Со времен распространения в обществе свободных нравов появилось и большое количество различных венерических заболеваний. ВИЧ-инфекции и СПИД причисляются пока к неизлечимым заболеваниям. Способ передачи в основном половым путем и через кровь. На все сто процентов защититься ни от одной болезни невозможно. Существует масса непредвиденных ситуаций, даже у людей, ведущих нравственный и чистоплотный образ жизни. В ситуации повышенной опасности заражения ВИЧ и другими опасными инфекциями неоценимую пользу оказывает диагностика крови.

Вконтакте

1 Назначение набора

1.1 Набор предназначен для одновременного выявления антител к вирусу иммунодефицита человека первого и второго типов (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) и антигена р24 ВИЧ-1 в сыворотке и плазме крови человека “in vitro” методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа.

2 Характеристика и принцип работы набора

2.1 Состав набора:

2.2 Основные компоненты набора " ИФА-HIV 1,2 AGAT " – иммуносорбент, раствор конъюгата №1 и конъюгат №2.

Иммуносорбент представляет собой полистироловый планшет, в лунках которого сорбирована смесь рекомбинантных антигенов ВИЧ-1 (gp41) и ВИЧ-2 (gp36) и моноклональных антител к антигену р24 ВИЧ-1.

Раствор конъюгата №1 представляет собой смесь меченых биотином моноклональных человеческих антител против антигена р24 ВИЧ-1 и меченых биотином рекомбинантных белков ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Конъюгат №2 представляет собой стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена.

Положительный контрольный образец АТ – сыворотка крови человека, содержащая антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, не содержащая антитела к вирусу гепатита С и Treponema pallidum, антиген р24 ВИЧ-1 и НВs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Положительный контрольный образец АГ – сыворотка крови человека содержащая нативный антиген р24 ВИЧ-1, не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С и Treponema pallidum и НВs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Отрицательный контрольный образец – сыворотка крови человека, не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВГС, антиген р24 ВИЧ-1 и НВs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Принцип работы набора. При внесении в лунки планшета раствора конъюгата №1 и образцов сывороток инфицированной крови антиген р24 связывается как со специфическими антителами на твердой фазе, так и с моноклональными биотинилированными анти-р24 антителами, входящими в состав раствора конъюгата №1; ВИЧ-специфические антитела связываются как с рекомбинантными антигенами ВИЧ-1 и ВИЧ-2, сорбированными на твердой фазе, так и с антигенами, входящими в состав раствора конъюгата №1, образуя комплексы антиген-антитело. Иммунные комплексы анти-р24 специфических антител и антигена р24 выявляются конъюгатом №2. После отмывания несвязавшихся компонентов в лунки планшета добавляют раствор субстрата пероксидазы (перекись водорода) и хромогена ТМБ.

Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя стоп-реагент (0,9 М раствор серной кислоты), и интенсивность окрашивания раствора в лунках измеряют на спектрофотометре как величину оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм.

Величина ОП прямо пропорциональна концентрации специфических антител и/или антигена р24 в образце сыворотки или плазмы. Чем выше содержание антител и/или антигена р24 в образце сыворотки, тем выше интенсивность окрашивания.

2.3 Набор рассчитан на проведение на проведение 24 постановок ИФА: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений , включая контрольные образцы.

3 Меры предосторожности при работе с набором

3.1 Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. Однако работа со всеми исследуемыми образцами сыворотки (плазмы) крови человека, которые следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В или любой другой возбудитель вирусной инфекции, с отработанными растворами и жидкостями, различным оборудованием, которое может быть загрязнено в процессе анализа, требует определенных мер безопасности при использовании набора:

Работу необходимо проводить в специально оборудованном помещении;

Работать необходимо с применением средств индивидуальной защиты и с соблюдением мер предосторожности в соответствии с требованиями , , и .

3.2 Стоп-реагент, содержащий серную кислоту, обладает раздражающим действием. При попадании на кожу и слизистые немедленно промыть большим количеством воды.

3.3 При работе с набором рабочие места должны быть обеспечены приточно-вытяжной вентиляцией.

3.4 Все лица, работающие в лаборатории с наборами, должны проходить обязательный медицинский осмотр в соответствии с требованиями .

3.5 Утилизация медицинских отходов и/или неиспользованных наборов с истекшим сроком годности должна производиться в соответствии с требованиями .

4 Правила работы с набором

4.1 Для исключения ложных результатов исследуемые образцы необходимо готовить и хранить в условиях, предотвращающих бактериальный пророст. Необходимо осветлять образцы сывороток, содержащие агрегированные компоненты сыворотки или осадок, при помощи центрифугирования в течение (5-10) мин при скорости вращения 3000 об/мин. Образцы сывороток можно хранить при температуре (2-8) °С не более 5 сут. Замороженные образцы (желательно до температуры не менее минус 20 °С) можно хранить не более 1 года. Необходимо избегать повторных циклов замораживания-оттаивания образцов.

Необходимо помнить, что образцы с гемолизом, гиперлипидемией, бактериальным проростом, а также длительно хранившиеся без замораживания не пригодны для анализа.

Надежность результатов зависит от выполнения следующих правил:

Не допускается использование набора после окончания срока годности, а также смешивание компонентов наборов разных серий;

Для приготовления каждого реагента должна использоваться отдельная емкость;

Всю используемую для приготовления реагентов посуду не обрабатывать дезрастворами и моющими средствами. В случае необходимости промыть водой питьевой проточной, а затем пять раз ополоснуть дистиллированной водой;

Для работы с хромогеном ТМБ и РХ необходимо использовать отдельные емкости для растворов, наконечники для пипеток, посуду.

Необходимо обратить внимание на тщательное перемешивание реагентов;

Время между заполнением и опорожнением лунок планшета растворами и реагентами должно быть не менее 30 с. Не допускается подсыхание лунок на всех этапах постановки ИФА;

При использовании промывателя следить за состоянием емкости для раствора для промывания планшета и соединительных шлангов: в них не должно быть признаков бактериального или грибкового роста;

Необходимо использовать пипетки автоматические со сменными наконечниками, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3 %);

Дозаторы и рабочие поверхности обрабатывать раствором с объемной долей спирта этилового 70 %. Не использовать хлорамин и другие хлорсодержащие вещества;

Для работы с исследуемыми и контрольными образцами рекомендуется использовать одноразовые наконечники для пипеток. Каждый образец сыворотки, а также реагенты набора необходимо отбирать отдельным наконечником.

При внесении в лунки РК-1 нельзя касаться наконечником пипетки поверхности планшета и раствора, находящегося в лунках.

Во время проведения анализа следует избегать попадания прямых солнечных лучей на рабочую поверхность.

4.2 При вскрытии и растворении лиофилизованных компонентов необходимо следить, чтобы на крышке и стенках флаконов не оставалось сухого вещества.

5 Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа

5.1 Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий проводить измерения оптической плотности растворов в лунках планшета при длине волны 450 нм;

Полу- или автоматическое устройство для промывания планшетов (вошер);

Суховоздушный термостат типа ТС-80 М2, поддерживающий температуру (37±1) °С, или аналогичный ему по характеристикам;

Пипетки одноканальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости от 0,01 до 5,0 мл;

Пипетки 8-ми канальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости до 0,5 мл;

Мерный цилиндр вместимостью 2000 мл;

Колба лабораторная вместимостью 2000 мл;

Флаконы стеклянные вместимостью 20 мл;

Ванночки для реагентов или чашки Петри (диаметр 100 мм);

Вата медицинская гигроскопическая;

Бумага фильтровальная;

Перчатки резиновые хирургические;

Раствор с объемной долей этилового спирта 70 %;

Раствор с массовой долей перекиси водорода 6 %;

Вода деионизированная или дистиллированная;

Контейнер для сбора твердых отходов;

Контейнер для слива жидких отходов.

6 Подготовка к проведению анализа

6.1 Набор реагентов перед проведением анализа извлечь из холодильника, открыть крышку коробки и выдержать компоненты набора при температуре (18-25) °С в течение 30 мин .

Все образцы сывороток (плазмы) и реагенты перед проведением анализа тщательно перемешать.

Расход реагентов набора для постановки анализа, который определяется количеством используемых стрипов, приведен в таблице А.1 Приложения А.

6.2 Приготовление раствора для промывания планшета

Внимание! Раствор для промывания планшета готовить за 15 мин до начала проведения анализа!

Если флакон с ФСБ-Т×25 содержит осадок, его необходимо прогреть перед использованием при температуре (37±1) °С до полного растворения осадка. В мерный цилиндр вместимостью 2000 мл внести содержимое флакона с ФСБ-Т×25, затем добавить дистиллированной воды до метки 1250 мл и аккуратно перемешать раствор. Раствор можно хранить при температуре (2-8) °С в течение 72 ч.

В случае использования одного или несколько стрипов содержимое флакона с ФСБ-Т×25 интенсивно встряхнуть в течение (20-30) с, отобрать необходимый объем раствора (таблица А.1) в мерный стакан или цилиндр, добавить необходимое количество дистиллированной воды и перемешать раствор. Неиспользованный ФСБ-Т×25 можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.3 Подготовка иммуносорбента

Иммуносорбент готов к использованию.

Открыть пакет и установить на рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре (2-8) °С в течение 3 месяцев.

6.4 Подготовка К + АТ, К – , РК-1, РР-К2, БРС и стоп-реагента

К + АТ, К – , РК-1, РР-К2, БРС и стоп-реагент готовы к использованию.

Внимание! Во флаконе с РК-1 возможно выпадение осадка. Для проведения анализа необходимо использовать надосадочную жидкость.

Неиспользованные РК-1, РР-К2, БРС и стоп-реагент после вскрытия флаконов можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

Остаток К + АТ и К - после вскрытия флакона можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.5 Приготовление раствора К + АГ

Внимание! Раствор К + АГ готовить за 15 мин до начала проведения анализа!

Для восстановления лиофилизированного К + АГ перед вскрытием флакона легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флакона или пробки. Открыть флакон и положить пробку перевернутой на сухую поверхность. Внести во флакон 0,8 мл дистиллированной воды. Флакон закрыть пробкой, выдержать в течение 10 мин при температуре (18-25) °С и аккуратно наклоняя и вращая флакон, перемешать его содержимое до полного растворения, избегая образования пены.

Восстановленный К + АГ можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение одного месяца, при температуре минус 20 °С – в течение шести месяцев. Допускается однократное замораживание-оттаивание восстановленного К + АГ.

6.6 Приготовление раствора Кг-2 в рабочем разведении

Из флакона с Кг-2 отобрать указанный в таблице А.1 объем и перенести во флакон с РР-К2. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество РР-К2, добавить Кг-2 в соответствии с таблицей А.1 и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Раствор Кг-2 в рабочем разведении готовят непосредственно перед использованием! Раствор Кг-2 в рабочем разведении можно хранить в течение 15 мин при температуре (18-25) °С. Использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток Кг-2 можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.7 Приготовление рабочего раствора субстрата

Флакон с хромогеном ТМБ необходимо прогреть перед использованием при температуре (37±1) ° С до полного растворения кристаллов .

Из флакона с хромогеном ТМБ отобрать указанный в таблице А.1 объем и перенести во флакон с БРС. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество БРС, добавить хромогена ТМБ в соответствии с таблицей А.1 и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Рабочий раствор субстрата готовят непосредственно перед использованием в защищенном от света месте! Раствор можно хранить в течение 20 мин при температуре (18-25) °С в защищенном от света месте.

Раствор необходимо предохранять от попадания света и контакта с металлами или ионами металлов. Перед использованием раствор субстрата должен быть бесцветным. Посуду, которая будет в ходе реакции контактировать с раствором субстрата, отмывать без применения синтетических моющих средств. Использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток хромогена ТМБ можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

7 Требования к промыванию планшета

На всех этапах промывания необходимо контролировать заполнение всех лунок и полное удаление (аспирацию) жидкости из них;

Необходимо при каждом промывании все лунки заполнить раствором до краев (0,30-0,35 мл в лунку), без переполнения и перетекания жидкости из соседних лунок;

Необходимо выдерживать лунки, заполненными раствором для промывания планшета, в течение 30 с;

При каждой аспирации тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамкой со стрипами в перевернутом положении по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге, положенной на лист полиэтилена;

Некачественное промывание планшета приводит к получению некорректных результатов.

8 Проведение анализа

8.1 В любые две лунки планшета внести по 0,07 мл (70 мкл) К + АТ , в две другие лунки– по 0,07 мл (70 мкл) К + АГ , в три другие лунки – по 0,07 мл (70 мкл) К – .

Внимание! При постановке ИФА на одном стрипе допускается использовать для К – - две лунки, для К + АТ – одну лунку, для К + АГ – одну лунку.

В остальные лунки планшета внести по 0,07 мл (70 мкл) исследуемых образцов сыворотки (плазмы) крови человека.

Внимание! Каждый образец необходимо отбирать одноразовым наконечником!

8.2 Во все лунки планшета поверх контрольных образцов и исследуемых образцов сыворотки (плазмы) крови сразу внести по 0,05 мл (50 мкл) РК-1 . Содержимое лунок перемешать осторожным постукиванием по краям планшета.

8.3 (37 ± 1) ° С в течение 60 мин .

Внимание! За (1-2) мин до окончания инкубации приготовить раствор Кг-2 в рабочем разведении (п 6.6).

8.4 Удалить содержимое лунок с помощью промывателя, затем промыть лунки планшета раствором для промывания планшета (п 6.2) семь раз.

8.5 Внести во все лунки планшета по 0,15 мл (150 мкл) раствора Кг-2 в рабочем разведении (п 6.6).

8.6 Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37 ± 1) ° С в течение 10 мин .

8.7 Удалить содержимое лунок планшета с помощью промывателя, затем промыть лунки планшетов раствором для промывания планшета (п 6.2) семь раз.

8.8 Во все лунки планшета внести по 0,15 мл (150 мкл) рабочего раствора субстрата (п 6.7).

При приготовлении рабочего раствора субстрата (п.6.7) флакон с хромогеном ТМБ необходимо прогреть перед использованием в течение (3-5) мин при температуре (37 ± 1)° С до полного растворения кристаллов.

8.9 Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37 ± 1) ° С в защищенном от света месте в течение 15 мин .

Внимание! По окончании инкубации в лунках с образцами сывороток, содержащими антитела к ВИЧ-1 и/или ВИЧ-2, и/или антиген р24 ВИЧ-1, произойдет изменение окраски раствора от бесцветной до голубой различной интенсивности в зависимости от концентрации антител и/или антигена в исследуемом образце сыворотки.

8.10 Остановить пероксидазную реакцию путем внесения во все лунки по 0,05 мл (50 мкл) стоп-реагента .

Внимание! В лунках с образцами сывороток, содержащими антитела к ВИЧ-1 и/или ВИЧ-2, и/или антиген р24 ВИЧ-1, произойдет изменение окраски раствора с голубой на желтую различной интенсивности.

8.11 Не позже чем через (1-2) мин после остановки реакции определить ОП в лунках в одноволновом режиме при длине волны 450 нм .

9 Обработка результатов анализа

9.2 Результаты учитывать только в том случае если:

Значение ОПср К - не превышает 0,2 ОЕ;

Каждое отдельное значение ОП К - не должно отклоняться от ОПср К - более чем на 30%. Если одно из трех значений ОП К - выходит за этот предел, его следует исключить из расчета ОПср К - . Если два из трех значений ОП К - выходят за этот предел, анализ следует повторить на реагентах нового набора;

Значение ОПср К + АТ более 1,0 ОЕ;

Значение ОПср К + АГ более 1,0 ОЕ.

9.3 При соблюдении выше перечисленных условий вычислить критическое значение (ОПкрит.), ОЕ, по формуле (1):

ОПкрит. = ОПср К - + 0,14 (1).

10 Аналитические и диагностические характеристики

Чувствительность набора реагентов ИФА-HIV 1,2 AGAT по выявлению антигена р24 ВИЧ-1 –

Специфичность набора реагентов ИФА-HIV 1,2 AGAT – 100 % Стандарт АТ(-)ВИЧ. Стандартная панель сывороток, не содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека первого и второго типов (ВИЧ-1,2) и антиген ВИЧ-1(р24).ОСО42-28-214-02П.Кат№INS-20. ЗАО «МБС».

11 Форма выпуска набора

11.1 Набор выпускается в пяти вариантах комплектации:

1 комплект 1Р – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 12 постановок ИФА на разборном планшете: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 96 определений, включая контрольные образцы;

2 комплект 2М – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 2 постановок ИФА на монолитных планшетах: 1 постановка – 1 планшет. Всего – 192 определений, включая контрольные образцы;

3 комплект 2Р – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 24 постановок ИФА на 2 разборны х планшетах: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений , включая контрольные образцы;

4 комплект А2М – проведение анализа на автоматическом анализаторе. Набор рассчитан на проведение 2 постановок ИФА на монолитных планшетах: 1 постановка – 1 планшет. Всего – 192 определений, включая контрольные образцы;

5 комплект А2Р – проведение анализа на автоматическом анализаторе. Набор рассчитан на проведение 24 постановок ИФА на 2 разборных планшетах: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений, включая контрольные образцы.

12 Условия хранения и применения набора

12.1 Хранение набора должно производиться в чистом, защищенном от влаги и света помещении при температуре (2-8)° С в течение всего срока годности. Запрещается замораживать компоненты набора.

12.2 Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.

12.3 Срок годности набора – 12 месяцев .

Приложение А

Таблица А.1 – Расход реагентов набора для постановки ИФА

Библиография